细胞凋亡过程中通常伴随着显著的细胞形态变化。在凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转至细胞膜表面；而在凋亡进行到中后期时，随着细胞膜通透性的增加，一些较大分子化合物（如碘化丙啶，PI）可自由进入细胞并使细胞核呈现红色荧光。

Annexin V-PI 检测方法原理

Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，具有与PS的高亲和力和特异性结合性。由于其无法穿透完整的细胞膜，早期凋亡的细胞膜仍然保持完整，对PI有拒染性。然而，在凋亡的中晚期以及死亡细胞中，PI能穿透细胞膜并导致细胞核着色。因此，结合使用Annexin V和PI，可以有效区分早期凋亡细胞与其他细胞。

Annexin V-PI 凋亡检测推荐（南宫28NG相信品牌力量）

产品名称：流式凋亡检测试剂盒
货号：AC12L033
规格：100T

操作步骤

对照管设置

1. 空白管：诱导凋亡细胞不加染料，用于电压调节；
2. 单染管：分别加入PI和荧光标记的Annexin V，用于补偿调节；
3. 实验管：诱导凋亡的细胞加上全部荧光染料；
4. 阴性管：正常培养细胞加入染料，确认细胞状态，排除假阳性。

悬浮细胞的收集与染色

1. 细胞凋亡刺激完成后，离心5分钟，弃去上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬并计数。
2. 取1~5×10⁵重悬细胞，离心5分钟，弃去上清，加入500µl结合液轻轻重悬细胞。
3. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5μL PI，轻轻混匀。
4. 室温避光孵育10分钟，可用铝箔阻挡光照。
5. 随后进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

贴壁细胞的收集与染色

1. 吸出细胞培养液至适宜的离心管，PBS洗涤贴壁细胞一次，使用胰酶细胞消化液（最好不含有EDTA）消化细胞。
2. 细胞消化后，按照悬浮细胞的操作步骤进行。

上机检测

染色孵育后，应立即进行流式细胞仪或荧光显微镜检测。

Annexin V-PI 检测注意事项

• 进行贴壁细胞检测时，若不易控制消化时间，建议使用Accutase细胞消化液，以减少细胞损伤并保持细胞膜上PS的分布。
• 选择Annexin V的荧光染料时，需要考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间较长或经过药物处理的细胞，注意细胞代谢物和药物本身的荧光，以避免干扰。建议使用Annexin V-APC。
• 染色完成后，不应进行固定，尽快完成检测，可将管子置于冰上以减少外界环境对结果的影响。
• 在统计凋亡细胞时，通常只统计早期凋亡细胞，因为仅有早期凋亡才具有生物学意义；当然也可根据文献统计总凋亡比例（早期与晚期凋亡之和），但单纯统计晚期凋亡比例相对意义不大。